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植物激素及其检测技术

什么是植物激素?

植物激素是植物合成的一类痕量有机化合物,他们在较低的浓度下就能引发生理反应,在植物的生长发育和环境应答中具有重要的作用。他们参与了植物的生命过程,包括种子休眠、萌芽、营养、生长、分化、生殖、成熟和衰老。1928年,温特证实了首个植物内源激素——生物素的存在,随后其他植物激素陆续被科学家发现。以前,人们将植物内源激素分为五大类:生长素(auxins)、赤霉素(gibberellins)、细胞分裂素(cytokinins)、乙烯(ethylene)、脱落酸(abscisic acid)。前三类激素能促进植物的生长发育,乙烯主要促进植物器官成熟,而脱落酸抑制生长发育。水杨酸(salicylic acid)油菜素内酯(brassinosteroids)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、多胺(polyamines)、酚类(phenolic compounds)、独角金内酯(Strigolactones)等植物激素陆续被发现。

植物激素
 图1. 植物激素。

主要的植物激素及其代表化合物的分子结构、名称及含量范围
 表1. 主要的植物激素及其代表化合物的分子结构、名称及含量范围(李艳华 2011)。

为什么要检测植物激素?

一方面,植物激素对于植物生长、发育和对环境响应起着重要的调控作用。另一方面,植物作为重要的农业产品、园艺产品等,植物激素(如细胞分裂素、生长素、油菜素内酯)能调节植物的株型结构和产量构成,从而提升作物的产量和品质,茉莉酸、水杨酸、油菜素内酯等多种激素在植物对抗病虫害中发挥重要作用。因此植物激素的定性、定量在研究植物激素作用机理、植物生命过程、提高农产品/园艺植株质量、和人类定向植物改造方面起到重要作用。

但是植物激素检测具有以下几个难点:

1、作为植物的次生代谢产物,含量极低。1g鲜样中的通常为ng级植物激素,甚至pg级;

2、不同样本含量差异大;样本越新鲜越好。

3、基质效应干扰严重。基质是样品中分析物以外的组分,常对分析物的分析鉴定产生干扰,影响结果的准确性,这种干扰被称为基质效应。

如何检测植物激素?

目前,主要有以下几个检测植物激素的方法:

  • 生物鉴定法:这是较早用于植物激素检测的方法,根据待测定的激素特性进行植物激素检测。比如1928年,温特利用生长素能使燕麦胚芽鞘弯曲的特性来鉴定生长素浓度。该方法对样本的纯度要求高,分辨率不高,重复性差,所以应用少。

  • 免疫检测法:该技术基于抗原与抗体的特异性结合,是比较常用的方法,具有较高的专一性。免疫检测方法又可以分为放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)。RIA的检测灵敏度高,重复性好,但是对实验条件要求高。ELISA相比而言,更简单易行,因此使用更为广泛。

  • 生物传感器:基于生物传感器的方法允许连续、直观的激素水平监测,主要分为电化学生物传感器、免疫传感器和遗传编码传感器。电化学生物传感器利用酶促氧化还原反应,并由转换器转化为可以被测定的电信号,从而测定植物激素,对某些植物激素特异的中间化合物也可用作生物传感器或电极。免疫传感器利用经过设计的适配体(单链RNA或DNA)折叠产生配体分子的结合位点,与目标植物激素特异性结合。遗传编码的生物传感器利用的是基于靶向植物激素启动子区域设计的植物激素遗传报告者。

  • 电化学生物传感器示例
          图2、电化学生物传感器示例(Novak, Napier et al. 2017)。

  • 色谱和色谱-质谱联用法:近年来,色谱和质谱技术不断发展,在植物激素检测的应用上越来越受青睐。色谱技术利用各组分在色谱固定相上保留性质的差异实现激素分离,基于色谱图,可以得出样本含量和纯度信息。质谱技术可以将不同质量的离子按照质荷比(m/z)进行定性、定量及结构分析,质谱法是可以确定分子质量的方法,灵敏度高,样品需求小,由于其高灵敏性和功能,在实际应用中较为广泛。

    • 气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术可同时分析多种植物激素,准确性高,灵敏度高,适合分析具有一定挥发性、弱极性的物质,因此在GC-MS分析前要衍生成相应的挥发性衍生物,但高温容易降解热不稳定化合物。气相色谱与串联质谱(MS-MS)联用能更一步提高对于复杂内源激素检测的灵敏性。内标法(理想的内标物为同位素)可以减少样本提取、纯化时的损失、仪器误差,使得定量更为准确。

    • 液相色谱与质谱联用(LC-MS)和高效液相色谱质谱法(HPLC-MS)也用于植物激素的纯化、鉴定和定量分析,主要用于不挥发性化合物、极性化合物和热不稳定性化合物的分析鉴定。LC-MS与GC-MS相比,减少了繁琐的衍生步骤,也减少了时间花费,避免了衍生过程带来的实验误差。超高液相色谱法(UPLC)相较于HPLC和LC,增加了分析的通量,灵敏度,和色谱峰容量。因此,也常和MS连用,用于植物激素分离鉴定。(MS-MS)串联质谱可以进一步进行激素的结构分析,结合多反应选择监控(MRM)可以提高选择性和定量检测限度。内标法可以使结果更为灵敏和可靠。

    LC/MS
     图3、LC/MS。

  • 其他方法:其他还有毛细血管技术(CE)、光谱法、电化学法等,但是由于自身技术的限制,都没有质谱法应用广泛。比如,毛细管技术虽然样本消耗少、分离效果好,但是灵敏度和重现性方面表现略差。

参考文献:

[1]李艳华. 基于质谱技术的植物激素高效分析方法研究[D]. 中国农业科学院, 2011.

[2]陈菲, 陈丽璇, 刘鸿洲, et al. 质谱技术在植物内源激素检测中的应用(综述)[J]. 亚热带植物科学, 2010, 39(4).

[3]Novak, O., R. Napier and K. Ljung (2017). "Zooming In on Plant Hormone Analysis: Tissue- and Cell-Specific Approaches." Annu Rev Plant Biol 68: 323-348.

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