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小白与APT实验猿——细胞样本本地预处理

细胞是蛋白质组学实验中非常常见的样本之一,但是经APT实验猿鉴定认证后,得出一个结论,那就是越是常见的样本,越容易出现一些“白白”的问题,特别是在样本制备的过程中。这样不仅拖延了实验的时间,增加了实验成本,还浪费了实验猿的感情(西施捧心状)。

当“细胞样本君”来到APT实验室,却……

APT实验猿:客户又送来一个没有本地预处理的哺乳细胞样本,囧o(╯□╰)o!

小白(也不知道是从哪蹦出来的):怎么啦,哺乳动物的细胞样本需要本地预处理吗?

APT实验猿:是啊。哺乳动物的细胞样本比较敏感,万一在寄送过程中,低温环境不够稳定,也许细胞内的蛋白状态会变化啦,实验结果可能难以反映真实的样本状态,可能会导致最终的实验结果有问题哦。

小白:有这么大的风险啊,怎么办?

APT实验猿:建议重新送样咯,而且记住要本地先处理一下哦。处理方式是:收集的细胞沉淀用SDT(4% SDS,100mM Tris-HCl,1mM DTT,pH7.6)裂解,然后沸水浴5-10min,低温保存并寄送即可啦,我们会再做进一步的处理和提取。

小白:这样啊。那我上次处理了一个细菌样本,客户送的是没有处理过的菌体沉淀,这个会不会有问题啊?

吐槽声:嘘……你什么时候处理过细菌样本啦????

APT实验猿:别担心,细菌、真菌的细胞样本相对哺乳动物细胞更稳定,通常可以以细胞沉淀的形式进行保存和寄送。但是不要送细胞悬液,因为细胞悬液冻融后,再进行细胞离心等操作,细胞的状态可能有所改变,而且也许会发生细胞破裂,导致蛋白丢失。

重新送样之后……

APT实验猿:客户这次送来的样本是经过预处理了,但是怎么这么红啊?!

小白:是很红啊,有什么问题么?

APT实验猿(柯南附体):我推测客户收集细胞样本时,没有用PBS反复洗涤,导致培养基成分有较多残留,所以很红

小白:培养基残留会有什么影响么?

APT实验猿:如果细胞培养时采用的是有血清的培养条件,当培养基中的成分没有处理干净时,其中血清成分就会残留于细胞样本中。而通常细胞培养采用的血清浓度都是非常高的,残留的血清成分就会成为细胞蛋白提取液中的高丰度蛋白。质谱在进行信号采集时,就可能会反复采集到这些高丰度的蛋白信号,进而会影响到我们想要分析的细胞蛋白的鉴定效果。

小白:如果不是血清培养,而是其他培养基培养的呢?

APT实验猿:不错,学会举一反三了。如果培养基中没有添加高浓度的蛋白类成分,那么影响可能不会很大,但是如果培养基中存在糖类、生物质等成分,这些成分的残留也可能会对样本的制备和酶解产生一定的影响。所以,无论是什么类型的细胞样本都建议在样本收集时,采用PBS等缓冲液洗涤细胞2-3次以上,每次洗涤的时候将上清尽量弃干净,然后收集细胞沉淀,以避免培养基残留成分对后续分析的可能影响

那细胞上清样本呢???

小白:怎么客户送来的细胞上清样本,蛋白提取后跑出来的SDS-PAGE胶上,有几条这么深的蛋白条带啊,而其他区域的条带就非常弱??

APT实验猿:很有可能客户收集的是含有高浓度血清的上清样本,这几条条带应该是来自于血清蛋白的。

小白:哦,我明白了。刚才你有讲过,如果有高丰度的血清成分的话,这些高丰度蛋白就会影响到上清中细胞分泌的低丰度蛋白的后续分析效果,是吧?

APT实验猿:Bingo。所以一般我们建议客户收集细胞上清时,采用无血清或极低血清的培养基,以避免引入血清高丰度成分。

但是,你只考虑到了最主要的原因,还有一些其他可能因素,比如:血清中也会存在一些功能蛋白,如细胞因子等,因此我们最终难以界定定性和定量结果中,哪些贡献是来自于细胞分泌的蛋白,还是来自于原有的血清蛋白成分。

小白:如此说来,如果是用蛋白胨等蛋白类培养基收集的上清样本,其中就会有大量的培养基蛋白,对后续的分析干扰就会非常大了啊,一般是难以去进行分析的吧。

APT实验猿:对的。恭喜你,你可以成为客户的大白了。

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