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Autophagy:自噬影响雄性不育?武汉大学孙蒙祥团队首次揭示花粉启动萌发的关键环节

众所周知,自噬在植物的环境胁迫响应中起着关键作用。然而,自噬如何影响植物正常的生理和发育过程则知之甚少。在被子植物中,花粉萌发产生花粉管是受精产生种子的关键的第一步。花粉萌发需要新陈代谢,并依赖于高水平的细胞质重组活动,以支持形态转变。目前自噬在这一过程中的作用尚不清楚。

今年4月,武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室的研究团队在《Autophagy》(IF=11.059)杂志上在线发表了题为“Autophagy-Mediated Compartmental Cytoplasmic Deletion is Essential for Tobacco Pollen Germination and Male Fertility”的研究论文。该研究首次揭示自噬在雄配子体发育过程中发挥作用,揭示了自噬介导的细胞质选择性清除是花粉启动萌发的关键环节。

研究材料

脂质组和蛋白质组学:WT,ATG2RNAi和ATG5RNAi植株的花粉。

技术方法

蛋白质组学、脂质组学

研究路线

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研究结果

1. 表型确认:花粉萌发与自噬活性是否有关?

为了证明花粉萌发与自噬活性有关,作者用标记自噬体的ATG8特异性抗体对花粉管进行免疫荧光标记。结果表明,在萌发30分钟后(30 MAG),萌发孔的自噬体数量急剧增加。在花粉萌发2小时后(2 HAG),自噬体数量达到高峰,此后逐渐减少。这些数据表明,自噬在花粉水化过程中暂时被激活,这与自噬是胞质重组的一部分,协调花粉管萌发的极化生长是一致的。

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2. 遗传学分析:自噬对花粉正常萌发十分重要

为了确定花粉萌发是否需要自噬,作者用RNAi沉默了3种单拷贝自噬特异性ATGs基因:ATG2、ATG5和ATG7。选择3个独立的ATG2和ATG7RNAi株系和4个ATG5RNAi株系进行详细分析。结果发现,ATG-RNAi株系中只有29.7%-54.6%的花粉能萌发,显著低于野生型。ATG8的免疫荧光检测表明,ATG2、ATG5或ATG7的下调导致萌发孔处自噬体数量减少。

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那么ATG沉默材料中花粉萌发孔自噬体减少的原因是什么呢?是由于自噬体形成不足?还是因为自噬体快速降解?为了回答这个问题,研究人员采用抑制剂Con A来阻断自噬体的降解。结果显示,与WT花粉相反,经Con A处理的ATG2-、ATG5-和ATG7沉默株系花粉中自噬体的积累没有达到相同水平,表明ATG沉默植株中自噬体数量的减少是由于自噬体形成不足所致。

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为了证实ATG沉默会导致花粉自噬活性降低,作者收集了WT和ATG沉默株系花粉的质膜部分,然后在PLD(磷脂酶D)预处理前后用免疫印迹法检测ATG8的脂质沉积。结果表明,与野生花粉相比,ATG2-和ATG5沉默株系花粉中的脂化ATG8水平显著降低,表明ATG2或ATG5的下调抑制自噬体的形成并降低自噬活性。这些结果证实了ATG沉默植株的花粉萌发缺陷是由于自噬活性降低所致。透射电镜(TEM)在ATG沉默花粉的萌发孔处发现了一个凸出的细胞质层,说明自噬介导的细胞质缺失是正常花粉萌发过程中所必需的。

综上,ATGs沉默会抑制花粉萌发和细胞质缺失。

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3. 脂质组学分析表型变化:ATGs基因的沉默改变自噬途径的调节和信号脂质

脂类作为自噬底物,在本项研究中被重点讨论。研究人员采用了脂质组学对WT和ATG-RNAi株系花粉的脂质组分进行对比分析,以期探讨花粉萌发初期自噬与脂类的关系。结果发现,与WT相比,ATGs沉默花粉中的磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)含量水平降低,双磷脂酰甘油(CL)和神经酰胺(Cer)水平升高。

三酰甘油(TAG)是许多植物花粉发育过程中脂质体中的主要成分,抑制自噬可导致植物体内贮藏脂质的增加。因此,作者重点研究了TAGs和二酰甘油(DAGs,TAGs的中间代谢物)的组成,在ATG2和ATG5沉默株系的花粉中观察到TAGs和DAGs的显著积累。脂质组学分析结果显示,自噬是花粉萌发过程中脂质分布变化的基础。

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4. 蛋白质组学揭示调控机制:线粒体相关途径在花粉萌发中的作用

为了评估自噬活性降低对ATG2和ATG5下游参与花粉萌发调控途径的影响,采用TMT标记定量蛋白组学技术对WT和ATG沉默株系花粉中的蛋白进行了检测。其中,与野生型花粉相比,ATG2和ATG5沉默株系花粉中4.3%和2.8%的蛋白质表达水平升高,而2.6%和2.8%的蛋白表达水平下调。说明自噬对花粉蛋白质组有着显著的影响。

GO富集分析显示,线粒体质子转运ATP合酶复合物、细胞氮化合物生物合成过程和ATP合成耦合质子转运在下调蛋白中富集,而膜相关组分、小GTPase介导的信号转导在上调蛋白中富集。因此,ATG2和ATG5可能通过线粒体的ATP和蛋白质合成途径来调节花粉萌发。以上结果表明,ATG2和ATG5依赖于花粉萌发中的自噬功能,也影响下游不同的细胞途径。

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结论

本文证实了花粉萌发伴随着自噬活性的提高,而花粉管的成功萌发则依赖于自噬介导的细胞质缺失。脂质组学分析表明,自噬诱导的花粉萌发的抑制,伴随着贮藏和信号脂类的变化。蛋白质组分析显示自噬可能通过下游线粒体相关途径在花粉萌发中发挥作用。这些发现揭示了自噬在启动花粉萌发中的关键作用,并为胞质缺失对雄性不育性的影响提供了证据。


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