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【客户文献】苹果叶片iTRAQ磷酸化研究


Significant and unique changes in phosphorylation levels of four leaf phosphoproteins in two apple rootstock genotypes under drought stress.

研究背景:干旱胁迫对于植物来说,是一个全球普遍存在的问题。会限制植物的生长发育。西北是我国苹果的最大产区,长期的中度干旱是限制苹果产业发展的一个重要因素,然而目前果树方面关于中度干旱胁迫响应的分子机制研究较少。

样本来源:苹果砧木叶片组织,4组样本分别来源于干旱敏感型材料M26(干旱处理、对照)、干旱耐受型材料MBB(干旱处理、对照)。

技术路线:iTRAQ,三个生物学重复

研究结果:

1. 中度干旱胁迫响应的生理变化

研究团队测定了4组样本的相对含水量(RWC)、叶面积(LA)、比叶重(LMA)、游离脯氨酸含量(CFP)、可溶性糖含量(CSS)、丙二醛含量 (MDA)。生理实验结果显示,RWC, CFP, CSS以及MDA的变化可能会影响苹果砧木对于中度干旱耐受程度。与M26相比,MBB在中度干旱胁迫下能够产生更多的渗透调节物质。

2. 磷酸化修饰位点以及磷酸化蛋白鉴定

本次共鉴定到595个磷酸化肽段,682个磷酸化修饰位点以及446个磷酸化蛋白。这682个磷酸化修饰位点分别位于丝氨酸(86.95%)、苏氨酸(11.73%)以及酪氨酸(1.32%)。

磷酸化修饰位点分布

磷酸化修饰位点分布

3. 差异磷酸化蛋白鉴定及生物信息学分析

通过分别与对照比较,中度干旱胁迫下的M26和MBB中,磷酸化水平显著变化的蛋白分别为5个和35个。其中4个在两个材料中都有,这有可能是两个基因型在响应干旱胁迫的机制方面有一些相似之处。在本次鉴定446个的蛋白中,有26个为蛋白激酶,其中10个为常见的干旱胁迫响应激酶,但在本次研究中,这些激酶几乎都没有表现出显著的表达差异。

在获得差异磷酸化修饰肽段及蛋白信息后,研究团队进行了GO分析。结果表明这些差异磷酸化蛋白与代谢、转录、翻译和蛋白加工等有关。

差异蛋白质的Venn图

差异蛋白质的Venn图

差异磷酸化蛋白质的GO功能分析

差异磷酸化蛋白质的GO功能分析

随后,研究团队利用motif-X对于差异蛋白的磷酸化修饰进行特征分析,结果表明,在差异磷酸化蛋白中,磷酸化修饰均位于丝氨酸,且[PxsP], [sP], [sD], [Rxxs], [sxP] 和 [sxs]等6种修饰特征最为普遍。

差异磷酸化蛋白质的修饰特征分析

差异磷酸化蛋白质的修饰特征分析

4. qRT-PCR 验证

研究团队选择了17个基因进行qRT-PCR 验证。结果表明,M26中ACBP4基因表达水平下降,此时蛋白磷酸化修饰水平上升。在MBB中,RPL5, eIF3B, Hsp70, Hsp70-90, DEK 以及 TUBA3在表达水平显著增加,与磷酸化水平变化趋势一致。这些结果表明,在中度干旱胁迫下,苹果砧木的mRNA与蛋白磷酸化修饰的变化有一定的相关性。

qRT-PCR 验证

qRT-PCR 验证

小编心得:本文利用蛋白质组学技术(iTRAQ)对比了干旱敏感基因型材料M26以及干旱耐受型MBB在中度干旱胁迫条件下的生理学和磷酸化蛋白组方面的变化。通过目前常见的生信分析(GO、Motif-X)以及验证手段(qPCR)获取可信度较高的目标性磷酸化修饰蛋白质,为进一步的安涛苹果中度干旱耐受的分子机制,提供更为准确的研究范围。

文献链接:【https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00438-017-1348-7】


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