干货分享

【APT新品强烈推介】iTRAQ / TMT / label-free+PRM一站式服务

今日关键词:Label-free筛选 PRM验证 细胞外囊泡

还在为如何筛选特异性差异蛋白烦恼吗?

还在为没有合适的抗体验证焦急吗?

今天我们将向各位强烈推荐一站式服务

从前期筛查iTRAQ / TMT / Label-free

到后期验证PRM

全部由我们完成

请欣赏文末的精彩广告

广告未动,案例先行

▼▼

Characterisation of extracellular vesicle-subsetsderived from brain endothelial

cells and analysis of their protein cargomodulation after TNF exposure

JournalofExtracellularVesicles

研究背景

近来关于细胞外囊泡extracellular vesicles,EVs,包括外泌体EXOs和细胞微泡MVs)的文章呈指数型增长,其被广泛应用于生物标志物研究工作。但是对于同一来源的外泌体和细胞微泡成分差别的研究却非常少。另一方面关于大脑血管内皮细胞(血脑屏障)EVs的分离与研究也非常罕见。

本文通过非靶向(label-free)和靶向蛋白质组(PRM)联合分析技术对肿瘤坏死因子(TNF)对血脑屏障及其分泌的EVs中蛋白表达的影响进行了深入探讨。

样本来源

hCMEC/D3 人类大脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3 humancerebral microvascular endothelial cells)



研究技术

Label-free蛋白组学(EVs:2次生物学重复*2次技术重复;细胞:6次生物学重复)+PRM

研究结果

1、采用差速离心法分离MVs(18,000g)和EXOs(100,000g)。通过免疫印迹(标志性蛋白),纳米粒子跟踪分析(NTA,囊泡大小)以及透射电镜(TEM,囊泡大小)确定MVs和EXOs的提取效果。同时发现TNF可以提高细胞分泌EVs的数量(至少两倍),但对其大小没有影响。

image.png

Figure 1. EV isolation and characterisation.

2、通过label free非标记蛋白质组学技术,细胞样品共定量到1758个蛋白 (≥ 2peptides);MVs 910个蛋白 (≥ 2 peptides);EXOs 575个蛋白 (≥ 2 peptides);366个蛋白在MVs和EXOs中都存在,大部分EVs中含有的蛋白在细胞中也都能检测到。

image.png

Figure
2. (a)Workflow overview. (b) Venn diagrams displaying the totalnumber
of proteins identified in cells, MVs and EXOs (≥ 2 peptides).

3、在生物学过程(biological processes)和细胞组分(cellular components)两个大类上进行GO富集分析细胞,MVs和EXOs很多GO分类一致不过显著性存在差异:EXOs中核糖体蛋白,胞外囊泡蛋白,溶酶体膜蛋白,黏连蛋白和整合素多一些;而MVs中内质网,线粒体以及细胞骨架蛋白更多。进一步分析发现细胞,MVs和EXOs三者间相关性很弱。

image.png

Figure 3. Heat maps displaying significant (p < 0.01) GO terms forbiological processes and cellular components.

4、利用two-way
ANOVA的统计分析方法来比较三种样品中TNF刺激对蛋白表达的影响,鉴定到差异表达的蛋白:细胞75个;MVs 323个;EXOs
219个。对这些差异蛋白进行生信分析,发现TNF和NF-κB信号通路的几个蛋白在细胞,MVs以及EXOs中都存在差异。

image.png

Figure
4. (a) Venn diagram displaying differentially expressed proteinsafter
exposure to TNF in different samples: cells, MVs and EXOs. For
detailedlist see Supplementary Table 2. (b) Comparison of the
fold-change (FC) ofproteins found to be significantly upor downregulated
after exposure to TNF (p< 0.01, |FC|> 1.5) in both cells and EVs.
The significant IPA canonicalpathways enriched in cell (c), MV (d) and
EXO (e) samples. The significance(–log10 (p-value)) for each pathway are
displayed. (f) Heat map showing theresults of the IPA upstream
regulator analysis.

5、最后,对一些特别关注的蛋白进行了靶向的PRM验证,如EXOs特异性蛋白(CD81, CD9, PDCD6IP和SDCB1)、MVs中蛋白(ATP5A1,RACGAP1和SEPT2)以及TNF引起的差异蛋白(ICAM1,VCAM1, STAT1, SOD2, PTX3, EGN, NFKB2),确证了label-free的数据。

image.png

Figure 5. PRM analysis of selected proteins enriched in EXOs (PDCD6IP,CD81, CD9, SDCB1) or in MVs (SEPT2, RACGAP1, ATP5A1).

image.png

Figure 6. PRM analysis of proteins found differentially expressed incells, MVs and EXOs after exposure to TNF.

小编心得

本文是一篇典型非靶向组学筛选结合靶向组学验证的文章,前期利用非靶向的定量蛋白质组学分析寻找生物样品中差异表达的蛋白,后期通过靶向PRM技术对近乎30个蛋白同时进行精确定量分析,验证数据。这篇文章也充分显示出了靶向蛋白质组PRM技术的巨大优势:可以同时对几十个甚至上百个蛋白进行精确定量分析。

广告同样很精彩:

iTRAQ+PRM

TMT+PRM

Label-free+PRM

“合二为一”

解决您前期差异定量,后期差异验证的烦恼


(0)

本文由 生物知识学习 作者:来源互联网 发表,转载请注明来源!

热评文章

发表评论