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CRISPR技术简介

  CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中,sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。
  虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与,但是在很多细菌的胞内都只需要一种内切酶(endonuclease)——Cas9就足够了,我们将这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统(typeIIsystems)。
  Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割,不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序(proto-spaceradjacentmotifs,PAM基序)。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体,还需要另外两个RNA分子的帮助,它们就是CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(trans-actingCRISPRRNA,tracrRNA)。crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。不过最近有研究发现,这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(single-guideRNA,sgRNA)。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称,在多种类型的细胞和生物体内,这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能,在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作了。
  细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复,这两种方式分别是同源重组修复机制(homologousrecombination,HR)和非同源末端连接修复机制(non-homologousendjoining,NHEJ),不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰,或者插入新的遗传信息。
  为满足不同实验需求,生物公司现推出CRISPR/Cas9技术服务,可根据您的需要量身定制您专属的CRISPR/Cas9载体,包括pCas9/gRNA1载体和pCas9/gRNA3载体,并可利用pCas9/gRNA1或pCas9/gRNA3载体进行基因敲除服务。
  (1)pCas9/gRNA1载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化Cas9蛋白和gRNA,只需转染一个质粒就能实现对靶基因的切割。


Cas9对DNA切割示意图

pCas9/gRNA1载体
  (2)pCas9/gRNA3载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化Cas9Nickase蛋白和gRNA。
  Cas9Nicknase是Cas9蛋白的D10A突变体,切割DNA单链。由于DNA上的Nick缺口会很快被细胞修复,一般不会造成基因突变。Cas9Nicknase需要成对的gRNA辅助才能实现DNA双链断裂。采用Nicknase蛋白可以提高基因敲除的特异性,但是对gRNA的设计要求较高。敲除效率也比Cas9蛋白低一些。简单地说,Cas9基因敲除效率更高,操作更容易;Cas9Nicknase特异性更高。

Cas9Nicknase对DNA切割示意图

pCas9/gRNA3载体
  

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